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L'imagerie biologique passe à la vidéo

Jacques Haas

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L'imagerie biologique passe à la vidéo

De gauche à droite : Eric Hosy et Gregory Giannone, de l'université Bordeaux 2 et Laurent Cognet.

© CNRS

Des chercheurs simplifient la microscopie de super-résolution dynamique pour l'étude dynamique de molécules à la surface des cellules. Et ouvrent la voie à des enregistrements longue durée.

Des molécules qui s'« allument » successivement à la surface des cellules, comme des ampoules sur une guirlande de Noël à l'échelle nanométrique... C'est le progrès réalisé par les équipes de Laurent Cognet et Daniel Choquet, respectivement physicien au Centre de physique moléculaire optique et hertzienne de l'université de Bordeaux 1, et biologiste au laboratoire Physiologie cellulaire de la synapse de l'université de Bordeaux 2. En particulier, il devient possible de « filmer » à 20 images par seconde l'évolution d'une cellule, par exemple un neurone, avec une résolution spatiale de 50 nanomètres. Et de reconstituer la trajectoire de protéines à leur surface.

L'amélioration apportée par la nouvelle méthode permet d'ores et déjà d'envisager un grand nombre d'études jusqu'alors inaccessibles par la microscopie optique conventionnelle. Les équipes bordelaises, qui concentrent leurs efforts depuis une dizaine d'années sur le fonctionnement du système nerveux, ont déjà entamé l'étude de la structuration dynamique des récepteurs de neurotransmetteurs dans les synapses de neurones vivants. « Il nous fallait une précision nanométrique, car de nombreux processus biologiques, comme le déplacement des protéines dans les synapses, se déroulent sur quelques centaines de nanomètres », relate Laurent Cognet.

Les chercheurs étaient auparavant confrontés à la limite de diffraction. Dans les méthodes traditionnelles, toutes les molécules renvoient simultanément un point lumineux de 250 nanomètres. Mais en deçà de 250 nanomètres entre deux molécules, les points lumineux se superposent : l'image est alors floue.

Depuis quelques années, des méthodes contournent ce problème. Parmi elles, la microscopie de super-résolution de molécules uniques. Elle permet, malgré la diffraction, de localiser très précisément un point lumineux, car il se trouve au centre de la tache de lumière qu'il nous renvoie. On utilise pour cela des molécules dont l'« allumage » peut être contrôlé par laser. Ainsi, à un instant donné, quelques molécules seulement sont allumées sur les objets qu'on souhaite imager. Un peu comme une guirlande de Noël où les ampoules s'allument successivement et donnent une idée de la forme globale du sapin.

Baisse de coût et flexibilité

L'inconvénient ? Pour allumer et éteindre les molécules une à une dans des cellules vivantes, on utilise des protéines fluorescentes et photoactivables introduites par ingénierie génétique. Un premier laser met alors les particules photoactivables dans la bonne conformation, et un second allume quelques molécules à la fois. L'opération est répétée pour obtenir, au final, l'image complète de l'assemblage moléculaire à étudier. « Cette méthode, mise au point en 2006, fonctionne plutôt bien. Mais pour l'appliquer à des cellules vivantes, il n'existait qu'un seul type de molécules fluorescentes, issues de méduses. Et il fallait modifier génétiquement les cellules pour les y introduire », explique Laurent Cognet. Au manque de souplesse s'ajoutait aussi un facteur d'imprécision. « L'inconvénient du changement génétique, c'est qu'on ne sait pas s'il modifie ou non le comportement des protéines à la surface des cellules », déplore Laurent Cognet. Autre inconvénient, la difficulté de suivre les trajectoires de molécules pendant plusieurs secondes. En effet, la fluorescence des molécules excitées s'évanouit souvent en moins d'une seconde.

La technique retenue par les chercheurs est l'immuno-marquage en temps réel. Les cellules vivantes sont placées dans une solution diluée d'anticorps fluorescents qui vont se lier à elles. Un type d'anticorps correspond à chaque type de cellules. Le marquage est progressif, au lieu d'avoir toutes les molécules allumées en même temps. « A un moment donné, les anticorps au voisinage des molécules se lient à elles et les rendent fluorescentes. Puis, quand les molécules s'éteignent, de nouveaux anticorps se lient à d'autres molécules et les allument à leur tour », explique Laurent Cognet. Avec leur technique, les chercheurs bordelais peuvent enregistrer plusieurs milliers de trajectoires d'une molécule à la surface d'une cellule à l'échelle nanométrique. Les chercheurs en ont démontré l'efficacité sur divers systèmes cellulaires (cellules hétérologues, fibroblastes ou neurones en cultures) pour étudier différentes molécules membranaires. « Tout dépend du type d'études que l'on veut mener. Pour garder un nombre raisonnable de données, on joue sur la densité en anticorps du milieu, donc sur la résolution, et sur le temps de l'expérience », détaille Laurent Cognet. La nouvelle méthode induit également une baisse de coût. « On retranche l'étape de modification génétique. Optiquement, un seul laser est nécessaire. De plus, il suffit de choisir l'anticorps correspondant à l'objet étudié », détaille le chercheur.

Les équipes bordelaises envisagent de poursuivre des études neurologiques, mais également cancérologiques. « Nous pourrons étudier plus finement l'organisation spatio-temporelle des protéines à l'échelle nanométrique. Mieux observer les protéines à la surface des cellules, c'est mieux comprendre comment elles interagissent de manière transitoire à des endroits qu'on saura mieux situer », précise Laurent Cognet. Un progrès pour un jour influer sur ces mécanismes et mieux comprendre l'effet de certaines drogues ou concevoir de nouvelles thérapies.

 

Bibliographie : Dynamic super-resolution imaging of endogenous proteins on living cells at ultra-high density, G. Giannone, E. Hosy, F. Levet, A. Constals, K. Schulze, A.I. Sobolevsky, M.P. Rosconi, E. Gouaux, R. Tampé, D. Choquet and L. Cognet, Biophysical Journal, 18 août 2010.

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