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Culture cellulaire : Trois étapes clés pour produire des protéines thérapeutiques

Sylvie Latieule
Culture cellulaire : Trois étapes clés pour produire des protéines thérapeutiques

Une opératrice surveille les paramètres de process d'un bioréacteur sur le site de Genzyme à Geel.

© Genzyme

La production sur cellules animales se décline en trois grandes étapes. En amont, le pilotage de la culture cellulaire ne tolère pas la moindre dérive. Au risque d'exprimer des protéines non désirées.

La bioproduction a le vent en poupe dans l'industrie pharmaceutique mondiale. Son principal intérêt est qu'elle permet de produire de nouvelles matières actives à partir du vivant, comme des protéines thérapeutiques, des anticorps monoclonaux, des vaccins, ainsi que divers produits d'extraction biologique (enzymes, protéines plasmatiques). Le point commun de toutes ces matières actives : ce sont des macromolécules que l'on ne serait pas en mesure de produire par la chimie fine classique. D'où le recours à la bioproduction. Mais compte tenu de la diversité des matières actives, il n'y a pas un, mais des procédés de bioproduction. Dans cet article, nous nous concentrerons sur le cas de la production de protéines thérapeutiques et d'anticorps monoclonaux par culture de cellules animales. Sachant que même pour ce type de macromolécules, il existe d'autres voies de production : utilisation de bactéries, de levures, recours à des animaux ou végétaux transgéniques...

La bioproduction sur cellules animales suit toujours le même protocole. Elle démarre par une phase d'upstream où la molécule d'intérêt est produite dans un bioréacteur, puis d'une phase de downstream consistant à isoler et purifier la biomolécule. La bioproduction s'achève par une mise en forme pharmaceutique. Ces trois étapes clés doivent s'enchaîner dans des temps relativement courts, de l'ordre de trois semaines. En effet, les protéines thérapeutiques et les anticorps monoclonaux ont des durées de vie limitées qui imposent d'aller rapidement jusqu'à la formulation pour les stabiliser.

Upstream

L'étape upstream démarre par une préparation du milieu de culture avec une phase de montée en échelle pour atteindre une concentration cellulaire optimale à innoculer dans le bioréacteur final. Pour cela, l'industriel puise un échantillon cellulaire dans sa « working cell bank » (WCB), constituée à partir d'une « master cell bank » (MCB). Ces réserves cellulaires, conçues pour couvrir plusieurs dizaines d'années de production, sont conservées dans plusieurs endroits distincts, ultra sécurisés. La perte de la « master cell bank » conduirait à un arrêt définitif de la production et de la commercialisation de la biomolécule ! L'échantillon de quelques cellules subit ensuite une amplification (ou croissance cellulaire) qui va s'opérer par des passages successifs dans des récipients de tailles de plus en plus importantes (de quelques millilitres à une cinquantaine de litres). Cette étape d'amplification peut durer de l'ordre de 4 à 5 jours. A noter que les cellules de mammifères utilisées pour la production des anticorps peuvent provenir de différentes origines : cellules ovariennes de hamster (CHO), cellules de souris (NS0, Sp2/0 Myélome), cellules humaines (PerC6).

Le milieu de culture est ensuite placé dans un bioréacteur qui peut être à usage unique (poches plastiques) pour des volumes allant jusqu'à 2000 litres. Au-delà et jusqu'à des volumes de 10 litres, on utilise systématiquement des bioréacteurs en inox. Pour avoir un ordre de grandeur, un bioréacteur de 10 litres conduira à peine à la production d'une quinzaine de kilogrammes de protéines, pouvant représenter plusieurs dizaines de millions d'euros ! Pour démarrer la bioproduction, les cellules sont nourries avec des nutriments essentiels comme des sels inorganiques, des acides aminés, des oligo-éléments, des vitamines, des sources de carbone, de l'oxygène, des agents tampons, des lipides. Le solvant utilisé est de l'eau PPI (qualité injectable). A ce stade, il est important que la cuve soit équipée d'un système d'agitation adapté et de dispositifs de régulation de température. Tandis que le contrôle de la production va se faire via l'utilisation de sondes de mesure (CO2 dissous, oxygène dissous, température, pH,... ) et de dispositifs d'échantillonnage pour réaliser des contrôles divers (concentration en substrat, en biomasse, densité d'ensemencement cellulaire... ). La bioproduction demande un pilotage très précis de tous ces paramètres. Dans ce domaine, on a coutume de dire que c'est le « procédé qui fait le produit », explique un formateur de l'IMT (Institut des métiers et des technologies pour les industries pharmaceutiques, cosmétiques et biotechnologiques) à Tours. En d'autres termes, des variations de procédé, même mineures, peuvent se traduire par une mauvaise expression des cellules qui n'aboutit pas à la protéine attendue. Au bout de 1 à 3 jours de réaction, la fin du « batch » est déterminée par une mesure de densité optique de la « soupe obtenue ». A l'intérieur, la quantité de molécule d'intérêt ne dépasse pas quelques pourcents. L'étape suivante est appelée « clarification primaire » du milieu de culture, ce qui correspond à la séparation entre la production et les cellules et déchets. Deux cas de figure se présentent : soit la protéine d'intérêt est restée à l'intérieur de la cellule (systèmes d'expression intracellulaire), soit elle a été sécrétée (systèmes d'expression extracellulaire). Le premier cas est le moins favorable, mais il reste le plus fréquent. Il faut d'abord récupérer toute la biomasse contenue dans le bioréacteur et éliminer le milieu de culture. Puis on rompt les cellules (c'est la lyse) soit par sonification, par congélation/décongélation ou par des moyens mécaniques. La molécule d'intérêt se trouve alors en mélange avec des fragments de cellules et toutes sortes de molécules qu'elles pouvaient contenir. Dans le deuxième cas -expression extracellulaire -, c'est le milieu de culture qu'il convient de récupérer, et non la biomasse, comme dans le cas des cellules CHO d'ovaires de hamster qui sont très utilisées en production d'anticorps monoclonaux. Ce milieu de culture contient bien la protéine, mais elle est mélangée à de nombreux déchets (des protéines ou autres molécules non désirées, des nutriments non consommés... ).

Ainsi que l'expression soit intra ou extracellulaire, il faut recourir à des opérations de centrifugation et de filtration en profondeur pour isoler la protéine d'intérêt. Une filtration tangentielle est souvent ajoutée pour concentrer le filtrat avant de passer à l'étape suivante.

Dowstream

La partie dowstream a pour objectif de réaliser une purification complète de la biomolécule. Elle est essentiellement constituée d'étapes de chromatographie. Ces opérations sont en général effectuées dans une zone de production distincte, avec des opérateurs parfois différents de ceux qui ont piloté la bioproduction. « Tout dépend de la stratégie des entreprises », estime l'IMT.

Le passage de l'upstream au dowstream se fait via un stockage intermédiaire dans des cuves. La purification démarre par une étape de chromatographie de capture. « Il s'agit d'une chromatographie d'affinité où la protéine est retenue sur le support, tandis que les impuretés sont éluées », explique un formateur. A ce stade, le support chromatographique utilisé est particulièrement onéreux, de l'ordre d'1 million d'euros pour le remplissage d'une seule colonne. Il existe un support commercial dit « protéine A » qui a la capacité de retenir la quasi-totalité des anticorps. Parfois, le support peut faire l'objet d'un développement spécifique. Au terme de cette opération, le taux de purification de la protéine avoisine les 90 %. Le filtrat peut aussi faire l'objet d'une purification tangentielle pour concentrer à nouveau son volume. « On constate que les industriels ajoutent, de plus en plus souvent, des étapes de filtration tangentielle avant les chromatographies pour réduire les volumes d'élution », ajoute le formateur. Cette chromatographie de capture est suivie généralement de chromatographies échangeuses d'ions. Ces étapes nécessitent l'utilisation de solvants de natures et de concentrations différentes. En parallèle, les variations de pH permettent l'inactivation de virus (pH acide) qui pouvaient être présents à l'intérieur des cellules utilisées en upstream. A l'issue des chromatographies échangeuses d'ions, les protéines non recherchées, des sels ou d'éventuels résidus sont éliminés. La pureté de la biomolécule grimpe alors à 99 %. La dernière purification est appelée « polishing » ou étape de polissage. C'est une étape de type « chromatographie hydrophobe ». Elle est destinée à éliminer des impuretés à l'état de traces, notamment des substances étroitement apparentées à la protéine cible (polymères, fragments et autres formes mal repliées). Pour finir, une filtration virale et une filtration stérilisante conduisent à un produit dont la pureté tend vers les 100%. « En bioproduction, il est difficile de définir un pourcentage de pureté très précis. L'important est d'être en mesure de garantir l'absence de produits dangereux », résume l'IMT.

Formulation

La mise en forme pharmaceutique requiert, pour sa part, des compétences en galénique. Ainsi, elle est réalisée dans des locaux dédiés, parfois sur un autre site pharmaceutique du groupe. Lorsque la protéine est en mesure de le supporter, on choisit de la lyophiliser pour mieux la conserver. Sinon, elle est directement formulée sous forme injectable (flacon, ampoule ou seringue) par ajout de sels pour ajuster le pH, d'adjuvants pour assurer sa conservation, sachant qu'il reste difficile de maintenir en solution de fortes concentrations de protéines sans risque d'agrégat. Le remplissage est effectué de façon aseptique, comme pour toutes les formes injectables. Même formulées, les protéines restent fragiles. Elles n'ont d'ailleurs qu'une faible période de péremption et doivent être conservées à basse température. Le respect de la chaîne du froid jusqu'à leur administration au patient, et les problématiques de reconstitution du produit, en général en milieu hospitalier, sont d'autres sources de problèmes, loin d'être réglées.

Cet article a été réalisé en collaboration avec trois formateurs de l'IMT : Eric Levacher, directeur technique et développement galénique, Bertrand Gatefin, chef de projet biotechnologies, Jérôme Grugier, formateur.

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